一、取材

动物麻醉后，解剖迅速取出所需的新鲜组织，立刻转到固定液中固定，此步应尽可能快速完成，防止组织暴露在外因此后续检测结果。

二、脱水

固定好的组织，转到15%蔗糖中脱水至沉底，再转到30%蔗糖中沉底即可。注意：所用的固定液和脱水剂均是用PBS缓冲液来配制，如果不是，会破坏细胞膜的结构。

三、速冻

1、将组织块平放于冰冻切片塑料模具内，缓缓加入包埋剂OCT到模具内，避免引起气泡。注意：需要切片的位置放到模具底部。

另外值得注意的是：一般在进行速冻之前，先用包埋剂浸没组织1-2h，然后再进行速冻。

2、用夹子夹住包埋好的组织放到液氮中，此时开始气化沸腾。注意：包埋模具切勿浸入液氮中，大约10-20s组织即迅速冰结成块。

注：要防止冰晶的产生，就是要控制组织的速冻过程，水的物理性质可知，水在-4度的时候，体积最大，这就说明了，如果水在-4度的停留时间越长，组织体内的冰晶体积就越大，数量就越多。因此，我们要做好冰冻切片，防止组织出现空泡，就是要在速冻过程中，减少水停留在-4的的时间。

3、制成冻块后，即可置入恒冷冻切片机进行切片。备注：若需要保存，应快速以铝箔或塑料薄膜封包，立即置入-80℃冰箱贮存备用。

4、托台上涂一层OCT包埋胶，将速冻好的组织置于涂好OCT的托台上，放上铁压台，利用重力压平组织。

四、切片

1、把冷冻好的组织承载器装到仪器的进退键上，手工旋转旋钮，观察是否固定好。

2、调好切片厚度，修片，修到需要的位置再切，恒温冰冻切片机为较理想的冰冻切片机，切片机置于低温密闭室内，切片时不受外界温度和环境影响，可连续切薄片至5-20μm，一般切10um既可。

3、切片时，低温室内温度以-15℃ ~ -22℃为宜，温度过低组织易破碎，抗卷板的位置及角度要适当，载玻片附贴组织切片，切勿上下移动。

注意：包埋剂的选择，包埋剂是对冰冻切片的质粒是一个重要的影响因素，常规的包埋剂有OCT剂，B超耦合剂和普通的胶水；其中B超耦合剂适用于细胞丰富质地较嫩的组织，普通胶水和OCT剂适用于纤维丰富质地偏硬的组织。

五、冰冻切片的注意事项
       (1) 速冻：是冰冻切片的关键，因为只有速冻才能减少组织内的冰晶，最好的办法是将速冻头压在组织上，冻好后就可切片。特别适用于较脆的组织。而含有脂肪较多的组织，最放放在液氮里处理。在液氮里冷冻要注意不要冻过头，2～3秒钟就要拿出来看一下，只要有4/5的组织已经冻住就可以了，待冷冻头拿出后刚好全部冻住，否则就会引起组织发脆，或冷冻头与组织分离 [医学教育网整理发布]。
        (2)固定：切片后应立即放入甲醇中固定，不能等切片干后再固定，后者容易造成细胞退变。一般来说甲醇作用快，收缩小，染色较清晰，是冰冻切片最理想的固定液。

注意: 此步是针对新鲜组织冰冻切片的固定方法。
       (3)包埋剂：一般用OCT包埋剂即可，也可用普通胶水代替，但要加入适量的水（胶水与水的比例大约在2：1左右）。太稀容易损伤切片刀；太稠会粘在切片上不容易洗掉,影响切片的质量。
        (4)冰冻用切片刀每次要用新的刀片，刀片的质量是影响冰冻切片的关键。

        (5)如果组织发脆，一般是冷冻过久则可等几分钟后再切，也可用手在组织上稍稍加温。
       (6)冷冻室的温度冬天一般设在-19℃左右，夏天设在-22℃左右。不同的组织,有不同的温度要求:肝脏、甲状腺组织温度控制在-15℃左右，脂肪组织一般在-35℃以下。
       (7) 冷冻切片机应长期处于恒温冷冻状态，经常的开关机器电源容易造成压缩机损伤。

表1 石蜡切片与冰冻切片的优缺点比较


表2 不同温度下各新鲜组织冷冻头和冷冻箱的温度

一般方法做的冰冻切片有如下的空泡（冰晶形成的结果）

结果展示