技术简介

细胞永生化是指体外分离培养的原代细胞受到自发的或受外界因素的影响，避免了正常细胞的衰老死亡过程，从而具有无限增殖能力的过程。衰老死亡是一种正常的不可逆的细胞生理过程，正常组织来源的原代细胞在通常的体外培养条件下可分裂生长，但细胞在不断增殖分裂的过程中会达到衰老M1期和致死M2期，细胞会停止分裂并启动凋亡过程。此时如果细胞在某些原因诱导下，恢复基因的稳定性，则可以逃离衰老死亡的正常生理过程达到无限增殖分裂的永生化状态。利用基因转染等技术将外源性永生化基因导入目的细胞内，从而建立永生化细胞株，以达到使体外培养的细胞具有无限增殖能力且细胞间无差异的目的。

哺乳动物细胞使用几种方法诱导细胞永生化。其中猿猴病毒40（SV40）T抗原和hTERT病毒诱导的细胞永生化最为简单可靠，应用广泛。

SV40 T抗原

SV40主要由大T、小T和结构蛋白组成。SV40的大T抗原片段常用于整合入宿主细胞基因组并表达，通过调控细胞周期，致使细胞登录无限增殖的永生化状态。目前对SV40转染宿主细胞登录永生化的机制推测可能是SV40大T抗原片段与p53蛋白及其相关蛋白结合形成复合体导致p53蛋白失活，使抑癌基因失效无法表达，从而防止细胞分裂停滞，调整宿主细胞周期，从而永生化。

端粒-端粒酶激活

端粒是维持染色体稳定、细胞寿命的重要结果，其长度与染色体复制次数成反比，由于端粒长短有限，一旦减少到极值，便不再具有保护染色体稳定的作用，随之发生细胞死亡。但是端粒中含有一种逆转录酶（TERT），它能催化作为模板的端粒酶反转录为端粒DNA，继而合成到染色体末端，不断弥补端粒的长度，使细胞持续生长。但是TERT通常在正常的真核细胞中是不被表达的，需要转基因等技术手段，构建真核表达载体，通过转染细胞继而实现细胞永生化。

    操作流程

   服务内容

1.  原代细胞分离纯化；

2.  永生化基因的慢病毒制备；

3.  慢病毒感染原代细胞并进行传代培养；

4.  永生化混合细胞进行抗生素筛选；

5.  永生化细胞系进行端粒酶基因表达和衰老检测。

   增值服务

1.  永生化细胞核型分析

2.  流式检测表面蛋白标记

3.  干细胞畸胎瘤形成检测实验

   项目案例

  以人间充质干细胞为例，展示永生化细胞制备、鉴定的相关结果

（1）     细胞形态图（抗生素筛选）

（2）     端粒酶表达检测

（3）     衰老检测